คือในการ expression protein ด้วยเซล BL21 ของผม หลังจากนำเซลทั้งหมดไป sonicate แล้ว ปั่นแยกเก็บส่วน supernate และนำ lysate ไปละลายใน 8M Urea แล้ว  นำไปปั่นเก็บของเหลวส่วน inclusion มาได้.. โปรตีนทั้งจาก supernate และ inclusion นี่ เราจำเป็นต้องใส่ protease inhibitor มั๊ยครับ ก่อนที่จะเก็บไว้ในตู้เย็น 4 องศา..
และผมมีปัญหาก็คือ โปรตีนบางตัวที่ express ออกมา ทั้ง supernate และ inclusion เมื่อนำมา purify ด้วย นิเกิลคอลั่ม แล้วอีลูทด้วย 500 mM Imidazole กลับไม่พบโปรตีนที่ต้องการเลย (ไม่ได้ equilibrate column ด้วย  buffer ที่มี Urea สำหรับเพียว inclusion protein เนื่องจากโปรตีนใน inclusion บางตัวที่เคยทำมา สามารถจับกับตัวบีดได้โดยไม่ต้อง equilibrate column) ในขณะที่ก่อนเพียวได้มีการนำโปรตีนทั้งสองส่วนมา run SDS-PAGE พบว่ามีส่วน band ของ protein ตามขนาดที่ต้องการ (แต่ขนาด band ไม่หนามาก)..  จึงอยากจะถามว่าสาเหตุที่ไม่สามารถเพียว  his-taq proteine ด้วย Ni2+ column ได้นั้น มีสาเหตุมาจากอะไรได้บ้างครับ  และมีวิธีการตรวจเช็ค  และแก้ไขอย่างไรได้บ้างครับ

ขอบคุณครับ