สวัสดีค่ะ วันนี้มีคำถามว่าด้วยเรื่องของ PCR

เริ่มต้น คือ เริ่มจากการเก็บ RNA จาก sample cell culture ด้วย TRizol reagent แล้วสกัด RNA จากนั้น convert เป็น cDNA เพื่อมาทำ PCR 2 แบบ คือ RT-qPCR หรือ real time PCR และอีกแบบคือ RT-PCR ธรรมดา ดู gene expression ยีนหนึ่ง ขอเรียกว่า ยีนA , Annealing temp 60C

ผลที่ได้
1. จาก RT-qPCR พบ product เกิดขึ้น 1 product, melting curve มีแค่พีคเดียวปกติดี นำ product มารัน gel electrophoresis พบ Product 1 band ที่ถูกต้อง คือ size ~200 bp

2. จาก RT-PCR ธรรมดา หลังจาก amp แล้วนำมารัน gel electrophoresis พบ product 3 band คือ ~200 bp, ~400 bp และ ~500 bp

จากผลข้างต้น เกิดจาก RNA ตัวอย่างเดียวกัน ใช้ cDNA จาก tube เดียวกัน primer สำหรับยีน A ทั้ง FW และ RW คู่เดียวกัน Annealing temp 60C เหมือนกัน เพื่อมาทำ RT-qPCR และ RT-PCR

แต่เพราะเหตุใด??? PCR product จาก RT-PCR จึงมีมากกว่า 1 band  (โดยดูจากการ gel electrophoresis) แต่ product ที่ได้จาก RT-qPCR ไม่พบ nonspecific band อีกสองอัน

รบกวนขอความช่วยเหลือ หรือข้อชี้แนะจากผู้รู้นะคะ ขอบคุณล่วงหน้าค่ะ